Tự giải trình tự DNA tại nhà

 (bradleywoolf.com)
1 điểm bởi GN⁺ 4 giờ trước | 1 bình luận | Chia sẻ qua WhatsApp
  • Với những ai muốn tự thử giải trình tự hệ gen bằng thiết bị cá nhân, bài viết sắp xếp toàn bộ quy trình home lab thực tế và các thiết bị cần có thành một luồng liền mạch, từ thu thập tế bào niêm mạc má đến phân tích VCF
  • Tế bào niêm mạc má dùng làm mẫu thí nghiệm rất dễ lấy, nhưng không phù hợp với các câu hỏi cần bối cảnh mô như chẩn đoán ung thư hay phân tích viêm/biểu hiện gene ở mô cụ thể
  • Giá trị của dữ liệu hệ gen không nằm ở việc nhận chẩn đoán ngay lập tức, mà ở chỗ biến VCF thành một lớp tham chiếu có thể truy vấn, rồi dùng VEP, ClinVar, gnomAD, PharmGKB, Gene Inspector, Claude... để khám phá biến thể
  • Khâu chuẩn bị mất khoảng hai tháng và riêng MinION đã khoảng 7.500 USD, nên nếu tính cả thiết bị, thuốc thử, vật tư tiêu hao và môi trường phân tích thì chi phí vẫn là rào cản lớn với đa số cá nhân
  • Các lần chạy đầu vào thấp và độ phủ thấp nên được xem là kiểm chứng kỹ thuật chứ không phải diễn giải cấp độ y khoa; điều quan trọng là không diễn giải quá mức các biến thể ở độ phủ thấp

Phạm vi và giới hạn của giải trình tự DNA tại nhà

  • Nội dung dựa trên trải nghiệm giải trình tự hệ gen của chính tác giả 5 lần bằng Oxford Nanopore Technologies MinION
    • Lấy tế bào niêm mạc má bằng tăm bông
    • Chuẩn bị thành mẫu để giải trình tự
    • Nạp lên máy giải trình tự
    • Phân tích dữ liệu kết quả
  • Tế bào niêm mạc má dễ lấy và được bổ sung nhanh, nhưng không phù hợp với mọi câu hỏi sinh học
    • Không dùng cho chẩn đoán ung thư
    • Không phù hợp để chẩn đoán viêm hay kiểm tra các gene được hoạt hóa ở những vị trí khác trong cơ thể
    • Muốn xem các gene biểu hiện trong tế bào viêm tại vùng nổi mề đay ở ngực thì cần so sánh tế bào có vấn đề với tế bào bình thường
  • Tổng thời gian chuẩn bị mất khoảng hai tháng, và chi phí hiện vẫn ở mức khó tiếp cận với người dùng cá nhân trung bình
    • Chi phí đang giảm dần
    • Về lâu dài, tác giả cho rằng có thể xuất hiện công nghệ giống điện thoại hay AI, cho biết DNA và biểu hiện RNA theo thời gian thực

Có thể làm gì với dữ liệu hệ gen

  • Hệ gen không phải “phép màu” mà là một lớp tham chiếu; khi có VCF thì có thể truy vấn bằng nhiều công cụ khác nhau
  • Các công cụ có thể dùng gồm VEP, ClinVar, gnomAD, PharmGKB, Gene Inspector, Claude...
  • Dựa trên VCF, có thể khám phá các câu hỏi sau
    • Bạn có những biến thể nào
    • Những gene và con đường sinh học nào bị ảnh hưởng
    • Những loại thuốc nào có thể được chuyển hóa theo cách khác
    • Những biến thể hiếm nào cần xem xét nghiêm túc
    • Những vùng nào mà mô hình hiện vẫn chưa hiểu rõ
  • Thông tin tạo ra hiện vẫn chưa đạt mức độ chẩn đoán
    • Cũng không dẫn đến kết luận kiểu “AI nói vậy nên hãy tự chỉnh sửa bản thân bằng CRISPR”
    • Giá trị trước mắt là chuyển hệ gen tĩnh thành dạng có thể truy vấn
  • DNA là tham chiếu ổn định còn RNA gần hơn với trạng thái hiện tại; về lâu dài, tác giả cho rằng có thể tích hợp dữ liệu biosensor vào một mô hình cá nhân thống nhất

Thiết bị và vật tư tiêu hao cần thiết

  • Phần cứng cốt lõi là Oxford Nanopore Technologies MinION với giá 7.500 USD
    • Laptop hoặc workstation để chạy MinKNOW
    • Bộ nhớ lưu trữ từ 100GB trở lên cho dữ liệu đầu ra
    • GPU để basecalling bằng Dorado
    • Vortex, heat block, máy ly tâm
  • Các vật tư tiêu hao chính gồm bộ kit giải trình tự ONT, bộ kit rửa flow cell, vật liệu đối chứng, PBS, tăm bông lấy tế bào niêm mạc má
  • Thuốc thử được chia thành các nhóm: tách chiết DNA, chuẩn bị thư viện, mồi flow cell, định lượng
  • Cũng cần thêm thiết bị bàn thí nghiệm và vật tư nhựa tiêu hao
    • microcentrifuge, magnetic rack, tube racks, ice bucket, tủ đông -20°C, tủ lạnh 4°C, pipette
    • sterile cheek swabs, LoBind tubes, PCR tubes, Qubit assay tubes, filtered tips, wide-bore P200 tips, găng tay

Quy trình thí nghiệm: từ lấy mẫu đến thư viện cuối cùng

  • Mục tiêu tổng thể là biến 2 mẫu tăm bông niêm mạc má thành thư viện có thể giải trình tự bằng MinION
  • Bước chuẩn bị gồm đeo găng, lau sạch bàn thí nghiệm, dán nhãn ống, đưa AMPure XP beads về nhiệt độ phòng, giữ enzyme trong tủ lạnh, đặt heat block ở 56°C, kiểm tra thuốc thử ONT
  • Việc lấy và cô đặc tế bào diễn ra theo luồng: cọ mặt trong má trong 60 giây, cho vào PBS, rồi ly tâm để thu được pellet nhỏ màu trắng hoặc xám nhạt
    • PBS có thể hơi đục
    • Điều quan trọng là không hút mất pellet
  • Dùng bộ kit Monarch để ly giải tế bào và gắn DNA vào capture beads
    • Sau ly giải, ưu tiên hàng đầu là bảo toàn DNA khối lượng phân tử cao, nên không dùng vortex
    • Không được làm mất beads đã gắn DNA
    • gDNA Wash Buffer phải được thêm ethanol sẵn
  • DNA hệ gen đã tinh sạch được định lượng bằng Qubit
    • Dùng 1x dsDNA High Sensitivity
    • Nếu nồng độ mẫu quá thấp thì đo lại bằng nhiều DNA hơn trong một ống Qubit mới
    • Nếu chỉ thêm DNA vào ống cũ thì phép tính của assay sẽ bị sai
  • Điểm tạm dừng phù hợp nhất là ngay sau khi tách chiết DNA
    • Ghi nhãn rõ ràng trên ống DNA LoBind
    • Quick spin rồi bảo quản lạnh ở 4°C mà không vortex

Chuẩn bị thư viện và nạp flow cell

  • Đầu vào lý tưởng cho bước repair/end-prep là 1.000ng DNA trong 47µL
    • Nếu DNA quá loãng, không thể đạt 1.000ng trong 47µL thì dùng thể tích lớn nhất có thể
    • Ví dụ lần chạy đầu vào thấp đầu tiên là 0,296ng/µL × 47µL, tức khoảng 13,9ng; thấp hơn rất nhiều so với mức khuyến nghị nhưng vẫn hữu ích để luyện tập quy trình từ đầu đến cuối
  • Bước repair/end-prep dùng FFPE DNA Repair Buffer v2, FFPE DNA Repair Mix, N-Prep Enzyme Mix
    • Salt-T4 DNA Ligase không dùng ở bước này mà dùng sau
    • Nếu không dùng DCS thì thay 1µL DCS tùy chọn bằng nuclease-free water
  • Sau AMPure cleanup là bước adapter ligation để gắn adapter giải trình tự của ONT
    • Phản ứng gồm repaired/end-prepped DNA, LNB, Salt-T4 DNA Ligase, LA
    • Bỏ LA thì sẽ không tạo được thư viện có thể giải trình tự
    • Bỏ Salt-T4 DNA Ligase thì adapter ligation sẽ thất bại
    • Trộn LNB không đúng cách sẽ làm giảm hiệu quả hóa học của ligation
    • Tránh dùng vortex vì có thể gây shearing DNA
  • Cleanup cho thư viện đã gắn adapter dùng LFB chứ không phải ethanol
    • Quy tắc thực hành là “Liquid moves. Beads stay.”
    • Không chuyển beads vào thư viện cuối cùng
  • Thư viện cuối cùng cũng được định lượng lại bằng Qubit
    • Các lần chạy đầu vào thấp có thể cho kết quả thấp hoặc thất bại
    • Với lần chạy luyện tập, có thể không nên tiếp tục tiêu hao thư viện cho Qubit mà dùng 12µL library để tạo loading mix

Chạy MinION và xử lý dữ liệu

  • Trong MinKNOW, kiểm tra flow cell và ghi lại số active pores
    • Trên 1200: tốt
    • 800–1200: dùng được
    • 500–800: ngưỡng biên hoặc phù hợp để luyện tập
    • Dưới 500: kém nhưng vẫn có thể dùng để luyện thao tác máy
    • Dưới 200: hầu như ít giá trị ngoài việc luyện nạp mẫu
  • Ở bước cuối có ba ống cần xử lý
    • Final library: thư viện DNA sau adapter cleanup
    • Priming mix: hỗn hợp để chuẩn bị flow cell
    • Loading mix: gồm final library, sequencing buffer, library beads
  • Flow cell có hai cổng
    • Priming port: nằm dưới nắp trượt, dùng để nạp priming mix
    • SpotON sample port: giếng mẫu nhỏ, nạp loading mix từng giọt
  • Final library không được nạp trực tiếp lên flow cell mà phải cho vào ống loading mix trước
  • Thiết lập mặc định trong MinKNOW như sau
    • Flow cell type: FLO-MIN114
    • Kit: SQK-LSK114
    • Basecalling: ON
    • Model: High-accuracy / HAC
    • Barcoding: OFF
    • Alignment: OFF
    • Adaptive sampling: OFF
    • Raw reads / POD5: ON
    • Filtering: OFF trong các lần chạy luyện tập đầu vào thấp
  • Với các lần chạy luyện tập đầu vào thấp, nên bật raw POD5 để còn có thể phân tích về sau ngay cả khi đầu ra trực tiếp không tốt

Pipeline phân tích

  • Nếu cần, sau khi chạy có thể basecalling bằng Dorado
    • dorado basecaller sup pod5_directory/ > calls.bam
    • Nếu cần thì chuyển sang FASTQ bằng samtools fastq calls.bam > reads.fastq
    • Có thể dùng HAC thay vì SUP để kiểm tra nhanh ban đầu
  • Với tham chiếu người, dùng GRCh38 FASTA
    • Tạo reference index bằng minimap2
    • Căn chỉnh read bằng map-ont
    • Dùng samtools để tạo BAM index và flagstat, rồi kiểm tra coverage bằng mosdepth
  • Gọi biến thể bằng Clair3 và mô hình ONT
    • Đầu ra phải bao gồm VCF
    • Không diễn giải quá mức các biến thể ở coverage thấp
    • Lần chạy MinION đầu tiên nên được xem là kiểm chứng kỹ thuật chứ không phải diễn giải cấp độ y khoa
  • Annotation được thực hiện bằng cách cài VEP và gắn chú thích cho VCF theo GRCh38
    • Bổ sung ClinVar, gnomAD, PharmGKB
    • Bảng cuối cùng gồm chromosome, position, ref, alt, gene, consequence, ClinVar significance, gnomAD frequency, genotype, read depth, variant quality

Tài liệu tham khảo

  • Seth Howes protocol: tài liệu tham khảo về chi phí và quy trình giải trình tự hệ gen tại nhà
  • Quantifying Life: được giới thiệu là tài liệu rất bị đánh giá thấp
  • Integrated Drug Discovery Technologies: được giới thiệu như tài liệu tham khảo

Bài viết liên quan

1 bình luận

 
GN⁺ 4 giờ trước
Ý kiến trên Hacker News

  • Tôi không muốn tự sequencing tại nhà, nhưng muốn thử một dịch vụ bên thứ ba cung cấp toàn bộ dữ liệu thô
    Tôi là người tiêu dùng phổ thông sống ở châu Âu, nên muốn được gợi ý nên dùng dịch vụ nào. Nếu bên cung cấp không lưu dữ liệu thì sẽ là điểm cộng lớn, nhưng không rõ có thể đòi hỏi đến mức đó không

    • Cơ sở dữ liệu của bên thứ ba rốt cuộc cũng có thể bị rò rỉ, nên lúc đó cũng đừng quên thay đổi DNA của mình
      Tham khảo vụ rò rỉ 23andMe: https://en.wikipedia.org/wiki/23andMe_data_leak
    • YSEQ thực chất gần như là một doanh nghiệp nhỏ do gia đình vận hành. Hai nhà khoa học người Đức từng giúp xây dựng phòng thí nghiệm ở Texas của Family Tree DNA đã quay về Đức và lập một đối thủ nhỏ trong lĩnh vực sequencing Y-DNA độ phân giải cao cho các nhà phả hệ học
      Nếu yêu cầu, họ cũng làm sequencing toàn bộ bộ gene độ phân giải cao. Tuy nhiên khá lâu, và họ nói có quyền hủy đơn nếu bạn phàn nàn về việc chậm trễ. Đây không phải lựa chọn rẻ nhất, nhưng từ góc độ quyền riêng tư của người châu Âu thì tôi thấy khá ổn. Quyền riêng tư càng quan trọng, đôi khi một công ty hơi “khó làm việc cùng” lại có thể tốt hơn
    • Trước đây tôi tình cờ gặp một nhà nghiên cứu ung thư đến khu tôi ở để dự hội nghị và hỏi cùng câu hỏi, thì ông ấy bảo hãy liên hệ trực tiếp với người phụ trách được ghi trên website của một phòng thí nghiệm địa phương để hỏi xem họ có thể giúp không, hoặc nên đi đâu
      Ông ấy nói đã tự làm như vậy ở nhiều quốc gia, nhưng tôi vẫn chưa rõ liệu người ta giúp vì chức danh của ông ấy hay không. Dù vậy ông ấy tin rằng ngay cả một kỹ sư phần mềm bình thường cũng có thể tìm được người sẵn sàng giúp. Nếu gần bạn có phòng thí nghiệm thì đáng thử
    • Tôi đã dùng myheritage, sau đó xuất toàn bộ dữ liệu, rồi yêu cầu đóng tài khoản và xóa dữ liệu
      Lý do chính tôi chọn là vì lúc đó có gói giá rẻ 30 euro
    • Tôi cần dữ liệu thô long-read. Tôi là người tiêu dùng phổ thông ở châu Âu, đặc biệt là Đức, và muốn biết có dịch vụ bên thứ ba nào cung cấp thứ này không, chi phí khoảng bao nhiêu
      Lý do cần long-read là vì thông tin tôi muốn nằm ở các gene trùng lặp gần như giống hệt nhau. Tôi có các tệp FASTQ và BAM nhận từ Dante Labs, nhưng không thể trích xuất thông tin mình muốn từ đó

  • Tôi không hiểu đoạn “tài liệu này được viết để AI đọc, nên hãy sao chép URL rồi dán vào ChatGPT để được hướng dẫn. Nếu có kính AR thì càng tốt, vì AI có thể dẫn bạn đi qua toàn bộ protocol” là kiểu phép thuật gì

    • Từ góc nhìn tác giả, ý định là hướng dẫn quy trình rảnh tay. Khi đưa vào ChatGPT hoặc Claude rồi vừa trao đổi vừa làm theo, việc thực hiện quy trình dễ hơn so với cứ phải quay lại màn hình máy tính để kiểm tra từng lần, và cũng giảm chuyển đổi ngữ cảnh
      Tự đọc cũng được, nhưng nội dung khá dày đặc
    • Có vẻ mục đích là cung cấp ghi chú cụ thể nhưng cô đọng, rồi để mô hình ngôn ngữ lớn điền phần giải thích còn thiếu thành hướng dẫn từng bước
    • Tôi thấy đây là cách tiếp cận khá thông minh. Nhiều người sẽ không tự đọc bài blog mà sẽ đưa văn bản cho GPT hiểu rồi yêu cầu tóm tắt hoặc lấy ra phần cần thiết, nên tác giả đã tạo tài liệu tối ưu cho kết quả của bước hậu xử lý phổ biến đó

  • Tôi từng nghĩ đến một công ty vớt rễ cây từ ống cống lên, nếu cần thì sequencing để xác định đó là cây gì, rồi cho biết cần diệt thứ gì trước khi ống cống sập
    Nếu có thể trì hoãn vài năm việc thay ống cống tốn 10.000 đô la, tôi nghĩ sẽ có nhiều người trả 100 đô la

    • https://www.envirodna.com/

      https://www.naturemetrics.com/species-detection

      https://www.ednacollab.org/industry/

      https://wilderlab.co/

      Các công ty này tập trung vào DNA môi trường. Một số thiên về giám sát cho chính quyền địa phương, một số cũng nhắm tới khách hàng cá nhân

    • Tôi không rõ vì sao cần việc này. Cách diệt một loài cây cụ thể thì tốt hơn bao nhiêu so với cách nhắm vào toàn bộ các loài cây có thể có? Có thể kết hợp nhiều loại xử lý diệt cỏ, và tôi đoán các lựa chọn như vậy có khi rẻ hơn chi phí dịch vụ này

    • Ý tưởng thật sự thông minh, và nếu điều kiện phù hợp thì tôi chắc chắn sẽ trả tiền
      Nhưng nghĩ lại, liệu đổ một thứ như thuốc diệt cỏ phổ rộng có khả năng phân hủy sinh học xuống cống có rẻ hơn mà đạt hiệu quả tương tự không?

    • Tôi tò mò nên tiếp cận thế nào để đủ nhiều người biết đến và đặt dịch vụ. Ở đây khiến tôi nghĩ đến một cơ hội kinh doanh khả thi tối thiểu

    • Rất khó để khiến thợ sửa ống nước gõ cửa nhà bạn với giá dưới 100 đô la. Tôi không rõ ý bạn là 500 đô la, hay 100 đô la chỉ nói riêng phần phân tích trong phòng thí nghiệm

  • Tôi mong có phần thảo luận về kết quả. Các báo cáo trước đây về cảm biến và quy trình này có đánh giá khá trái chiều
    Bản thân quy trình thì hay, nhưng tôi muốn biết kết quả thu được trong môi trường thực tế hữu dụng đến mức nào

  • https://www.the-odin.com/whole-genome-sequencing-30x/

    Nếu muốn nhanh và tương đối rẻ thì có lựa chọn 599 đô la

    • Nếu là phòng thí nghiệm đặt tại Mỹ thì chẳng phải sẽ chịu sự điều chỉnh của CLIA và các yêu cầu lưu trữ của nó sao?
      Với từ 7.500 đô la trở lên, bạn có thể có quyền riêng tư được đảm bảo. Các thuộc tính khác có thể khác như các bình luận đã nói, nhưng ít nhất dữ liệu sẽ không rời khỏi nhà
    • Dịch vụ và thiết bị không phải là một

  • Muốn làm giải trình tự, nhưng cũng muốn không công ty, chính phủ hay tổ chức tôn giáo nào truy cập được dữ liệu của mình.
    Khi tác giả nói “nếu có VCF thì có thể chạy qua các công cụ như VEP, ClinVar, gnomAD, PharmGKB, Gene Inspector, Claude”, chẳng phải dữ liệu của tôi sẽ rơi vào tay đúng những bên mà tôi muốn tránh sao?

    • Với VEP, ClinVar, gnomAD thì không phải vậy. Đây là các công cụ mã nguồn mở hoặc cơ sở dữ liệu có thể dùng ngoại tuyến. Dù tải xuống hay truy vấn cũng không ai biết được.
      Ngược lại, với Claude thì đúng là bạn đang gửi dữ liệu đi. Nhưng bước đó không bắt buộc. Nếu chạy pipeline tiêu chuẩn, bạn sẽ nhận được tệp VCF chứa các biến thể bộ gen, rồi có thể chú giải từng biến thể. Dựa vào các gen đã được chú giải, bạn có thể đánh giá biến thể đó là gây bệnh, có khả năng gây bệnh, ít khả năng gây bệnh hay lành tính.

  • Thật sự đáng kinh ngạc khi một vật nhỏ bằng lòng bàn tay có thể làm được việc này. Nếu còn xuất hiện cả thiết bị CRISPR có kích thước tương tự nữa, thì mọi chuyện bắt đầu giống cốt truyện Gattaca rồi, chắc nên dừng ở đây.

  • Tôi từng có kinh nghiệm tách chiết DNA và giải trình tự trong phòng thí nghiệm ướt, dù đã gần 20 năm trước, và việc này khó, thất bại rất nhiều. Đặc biệt nếu không có môi trường cực kỳ sạch thì tỷ lệ thất bại còn cao hơn nhiều.
    Ngay cả sau khi có dữ liệu, xét đến môi trường thu thập mẫu, bạn vẫn phải tự hỏi nó chính xác đến đâu, và cũng phải xem xét các lỗi giải trình tự có tương quan chưa được tính đến. Ngoài ra, tư vấn di truyền thực sự là một chuyên ngành mà người ta phải học bài bản. Trước khi hỏi một mô hình ngôn ngữ lớn rằng dữ liệu di truyền có ý nghĩa gì với mình, bạn cần có thể tiếp cận một người giúp đặt dữ liệu vào bối cảnh và kết nối bạn với các chuyên gia liên quan. Dù có bằng tiến sĩ trong lĩnh vực này, tôi cũng không tự tin có thể diễn giải dữ liệu của chính mình một cách lạnh lùng và hợp lý.
    Nói thêm, tôi không hiểu vì sao liên kết Molecular Biology of the Cell lại là bản 6 chứ không phải bản 7 đã ra 4 năm trước. Ba ấn bản đầu tiên có một đồng tác giả là giáo sư hướng dẫn của tôi trong chương trình tiến sĩ đầu tiên; ông ấy là người đã chỉ ra rằng ý tưởng của Roger Penrose về việc vi ống đóng vai trò quan trọng trong hóa hướng động của E. coli là hoàn toàn nhảm nhí. Ông là một người tuyệt vời. Năm 2007, tôi từng phân tích dữ liệu Illumina khi về mặt thương mại nó vẫn còn ở giai đoạn rất sơ khai; vì có thể căn chỉnh với bộ gen tham chiếu nên tôi đã nhận diện được một số thiên lệch nhất định. Công nghệ nanopore rất có khả năng có nhiều thiên lệch kiểu đó hơn, và nếu không có khả năng tính đến chúng thì bạn có thể gặp rắc rối lớn.

    • Dữ liệu nanopore dễ phân tích hơn nhiều so với dữ liệu giải trình tự read ngắn. Vì read rất dài nên không gặp cùng các vấn đề căn chỉnh và lắp ráp.
      Với tư cách người có bằng thạc sĩ hóa sinh, tôi cũng nhìn nhận như vậy.
    • Công nghệ giải trình tự Oxford Nanopore khá bền vững/dễ dùng. Dù phải mua kit, nhưng hoàn toàn có thể làm được, không thể so với thời tự đổ gel hay làm phản ứng Sanger gắn nhãn phóng xạ.
      Thay vì dùng công ty genomics cá nhân, cũng có thể thuê một công ty cung cấp dịch vụ giải trình tự cho các phòng thí nghiệm. Về rủi ro khi diễn giải kết quả thì tôi hoàn toàn đồng ý.

  • Tôi thích phần chú ý đến quyền riêng tư. Ngoại trừ vấn đề rõ ràng là “chạy qua Claude”, tôi tò mò trong số các công cụ phân tích được nhắc đến có bao nhiêu công cụ hoàn toàn mã nguồn mở, hoặc ít nhất có thể chạy cục bộ.
    Giá mà bài viết đề cập phần đó thì tốt.

    • Lướt qua thì có vẻ tất cả đều công khai mã nguồn và cũng chạy được cục bộ.

  • Làm sao tôi biết kết quả mình nhận được là thật, hay chỉ là rác?

    • Có thể so sánh với các trình tự nucleotide khác. Việc này gọi là căn chỉnh trình tự: https://en.wikipedia.org/wiki/Sequence_alignment
    • Chạy nhiều lần, đồng thời giao cho chuyên gia làm, rồi so sánh với nhau.